叙述人胚肾细胞的操作步骤与原理

　　人胚肾细胞：初期报道中指出该细胞基因组中含有腺病毒5（Ad5）基因组的左边端和右侧端的DNA，但是现在明确了只存在其左边端的DNA。经过对Ad5的插入点的克隆测序发现，Ad5的1——4 44位线性核苷酸整合入细胞染色体19q1 .2。该细胞为人类腺病毒载体扩增的宿主。可表达异常的玻连蛋白的细胞表面受体，由整合素β1亚单位和玻连蛋白受体α-v亚单位组成。生物安全级别为2级。细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的-5——0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。其操作步骤与原理以下：

　　1、人胚肾细胞操作步骤

　　1、冻存

　　（1）消化细胞(同实验2)，将细胞悬液搜集至离心管中。

　　（2）1000rpm离心10分钟，弃上清液。

　　（ ）沉淀加含保护液的培养，计数，调整至5×106/ml左右。

　　（4）将悬液分至冻存管中，每管1 ml。

　　（5）将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。

　　（6）贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。

　　（7）按下列顺序降温：室温→4℃(20分钟〕→冰箱冷冻室( 0分钟)→低温冰箱(- 0℃ 1小时)→气态氮( 0分钟)→液氮。

　　注意：操作时应当心，以免液氮冻伤。液氮定期检查，随时补充，绝对不能挥发干净，一般 0立升的液氮能用1——1.5月。

　　2、复苏

　　（1）细胞实验室进行常规消毒，紫外照射40min以上。

　　（2）培养液(DMEM)、0.25%胰蛋白酶(Trypsin)恒温水浴箱 70C预热。

　　（ ）二甲基亚砜(DMSO)在40C冰箱中冷藏 0min，备用。

　　二、人胚肾细胞原理

　　在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会构成冰晶，能致使细胞内产生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引发细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点下降。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。储存在-1 0℃以下的低温中能减少冰晶的形成。